GFP:
De groen fluorescente proteïne (GFP) is een eiwit dat lichte groene fluorescentie vertoont wanneer blootgesteld aan het blauw naar ultraviolet licht. GFP werd voor het eerst geïsoleerd uit de kwal Aequorea Victoria door Japanse wetenschapper Osamu Shimomura (hij won de Nobelprijs voor de Scheikunde in 2008 voor de ontdekking en ontwikkeling van GFP) in 1961. GFP had wijd gebruikt in de etikettering van de organismen voor identificatiedoeleinden. Als de GFP wordt afgeleverd in de cel, is de cel fluoresceren onder fluorescentie microscopie. In dit instructable zal ik gWiz GFP gebruiken.
Transfectie:
Transfectie is het proces van nucleïnezuren ingebruikneming cellen te blokkeren of express sommige functies van de cel. Transfectie kan onderverdeeld worden in chemische-gebaseerde transfectie (Lipofectamine 2000 door leven technologieën is de meest voorkomende), niet-chemische transfectie (electroporation is de meest voorkomende manier), en deeltje gebaseerde transfectie zoals magnetofection. Het is zeer moeilijk te transfect volledig gepolariseerde of volledig gedifferentieerde cellen met behulp van chemische-gebaseerde methode. Chemische-gebaseerde trasnfection en deeltje gebaseerde transfectie introduceert extra dingen (zoals lipide, polymeren en magnetische nanodeeltjes) naast de gezochte nucleic zuren in de cellen tijdens transfectie, en die extra materialen mogelijk maken ongewenste of onverwachte resultaat na transfectie. In electrodeporation, de celmembraan veel minuscule gaatjes onder de kracht van de elektrode wordt geopend en nucleïnezuren kunt krijgen in de cel via die gaten. Traditionele electroporation geldt een zeer hoge spanning (honderden tot duizenden volt) in celsuspensie. Het doodt allerlei cellen en voor Adherente cellen hun kenmerken zijn verschillend in celsuspensie en cellaag. Voor Adherente cellen geven in situ transfectie het beste resultaat aangezien de cellen in fysiologisch relevante postmeitotic staat. In dit instructable dat ik zal transfect volledig gedifferentieerd MDCK-G (Madin-Darby Canine nier cellen) cellen in situ met behulp van het systeem van de electroporation genaamd iPorator door primax biosciences. Deze machine maakt gebruik van een kleine stroom in plaats van een hoogspanning tijdens transfectie waardoor de celbeschadiging. Tijdens de transfectie groeien cellen op de poreuze membraan invoegen (geen resuspensie vereist). Dit systeem is het beste voor Adherente cellen. Dit systeem werkt echter niet voor schorsing cellen.
