Stap 1: Procedure:
1. zaad de cellen:
Het oogsten van de cellen van de MDCK-G uit de kolf. Hier overslaan ik de oogst-procedure, omdat het is een vrij standaard procedure in elke biologie lab. Zaad de cel Millicell 24-well cel cultuur inserts (Millipore PIRP12L04). Voor MDCK-G cel, ik gestoken 75K cellen/200uL in elke invoegen en 900ul van kweekmedium elke bottom feeder goed. Deze invoegen heeft 1um PET poreuze membraan (dat betekent dat er zijn tal van minuscule gaatjes op het membraan). Cellen kunnen voeding krijgen van beide kanten.
2. transfectie:
24 uur na het zaaien, de cellen van de MDCK-G zal betrekking hebben op de gehele membraan en de vorm een mono-laag.
De gWiz-GFP verdunnen met OPTI-MEM (Gibco 31985-070). De concentratie van de GFP die ik gebruik is 20ug/mL. Verwijder het kweekmedium uit het invoegen en 150uL van verdunde GFP binnen de invoegen toevoegen. De iPorator kan vier 24-well inserts (of twee 6-well insrts) transfect in een keer. Zodat ik vier inzetstukken met GFP bereiden.
iPorator vereist speciale elektroden tijdens de transfectie (bio-Primax, E24A1108). Vul onderaan elektrode kamer met 1mL van Opti-MEM. Breng de inzetstukken met GFP in bodem elektrode kamer en zet in de bovenste elektrode.
Volgende stap, zet de elektrode instellen met inzetstukken in de iPorator.
Klik op "Transfectie" in de gebruikersinterface.
Het programma heeft een ingebouwde MDCK-G transfectie protocol van DNA, dus ik gewoon Selecteer dat protocol en klik op "Start". Het duurt ongeveer 4 minuten tot het einde van de transfectie.
Na de transfectie, nemen de elektrode instellen uit de machine en de overdracht die de inserts terug naar de oorspronkelijke plaat van de feeder. Laat de inserts bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten met GFP dan het GFP vervangen door 200ul verse kweekmedium. De inserts terug naar cel cultuur incubator voor 24 uur het GFP-express laten zetten. Voor de gWiz-GFP, kunt u sommige expressie 2 uur na de transfectie zien, maar je moet wachten op zijn minst over nacht dat volledig express.
