Stap 16: Geavanceerde DIYBio genetische analyse: PCR en analyse van het Gel
De methode van de Polymerase-kettingreactie (PCR) is een van de meest krachtige tools in de geneticus werkset. PCR is een enzymatische methode logaritmisch sturen gerichte gebieden van DNA voor verdere analyse met behulp van een reeks van verwarming en koeling van stappen. Lang vervlogen zijn de dagen van stagiaires reactievaatjes van de monsters dompelen in waterbaden, tegenwoordig gebruiken wij geautomatiseerde thermische cyclers met een Peltier element aan cyclus temperaturen en een paar burger wetenschappers hebben zelfs DIY versies ontworpen voor ons DIY-biologen te gebruiken.
Veruit is de gemakkelijkste DIY thermische cycler die ik heb gezien de Gene Machine Gepost op populaire wetenschap. Het maakt gebruik van een lamp, een soort-van Easy-Bake-Oven benadering van een standaard thermische cycler. Een andere DIY thermische cycler maakt gebruik van weerstanden in dit instructable voor de Arduino-PCR. Nog een ander maakt gebruik van een soortgelijke aanpak met een verwarmingselement in de Coffee Cup Thermocycler.
Een machine van de Elektroforese van het gel kan worden gemakkelijker voor de DIY bioloog maken en uitvoeren. Ontwerpen van bereik in complexiteit van de beginner relatief (grote nadruk op de relatief) setup gepost op maken om de meer geavanceerde instructables voor de GellS of de mini gel systeem. Voor het uitvoeren van een gel, die ik zou adviseren met behulp van de methode beschreven in de bovengenoemde post van maken, maar meer geavanceerde gebruikers kunnen volgen de instructable voor de voorbereiding van het gel of natuurlijk het volgen van het protocol op Open natte Ware. Natuurlijk moet u kopen of maken van een pipet uit te voeren van de vloeibare transfers en maken van een transilluminator (zoals dit of dit) om ze te bekijken.
Natuurlijk, voor het uitvoeren van PCR moet u het ontwerpen van inleidingen te versterken uw opeenvolging van belang. De inleidingen zijn gewoon korte single-stranded DNA-sequenties die zijn gratis tot gebieden flankerende uw opeenvolging van belang. Ze zijn nodig voor DNA sequencing , evenals de meer DIY-Bio-vriendelijke volgnummer specifieke PCR (SSP) die vervolgens op een gel kan worden gedifferentieerd. Er zijn verschillende bedrijven te volgorde inleidingen van, door te zoeken op het internet voor "primer synthese bedrijven" kunt u mogelijk te vinden die wordt verzonden naar individuen of DIY labs. Voor rangschikken of SSP is het belangrijk om uit te voeren een eerste PCR te versterken en verrijken uw doel-regio, omvatten enkele tips voor succesvolle PCR:
- Doel PCR lengtes moet rond 500bp maar zelden mag ze hoger zijn dan 1000bp
- Neem aan dat ongeveer 30 seconden voor amplificatie per 500bp
- Houden van de voorwaartse en omgekeerde primer smelten temperaturen binnen ± 1 ° C indien mogelijk
- Vermijd targeting van regio's met herhalende nucleotiden (poly-traktaten, dwz. AAAAA... of GCGCGCGC...)
- Voorkomen dat uw inleidingen in regio's met gemeenschappelijke SNPs
U kunt zien in de afbeelding voor deze stap dat ben ik met behulp van Primer3 te vinden van inleidingen te richten op de bèta-thalassemie SNP voor het rangschikken. Met behulp van programma's zoals Primer3 voor primer ontwerp zijn een goed idee omdat ze zullen geven u primer combinaties met de beste thermodynamica (Zie hier voor primer kenmerken). Dan zult u willen controleren uw inleidingen in omgekeerde e-PCR (Zie tweede afbeelding) om te controleren of ze zijn specifiek voor alleen de volgorde van uw doelgroep. Klik voor meer informatie over het ontwerpen van een goede PCR reactie hier.
